沙场斗兽—隆美尔

（一）基因工程的诞生
1、理论上的三大发现
第一章 导论
目录
一、基因工程的诞生及其研究内容
2、技术上的三大发明
（二）基因工程研究的内容
（一）凝胶电泳
二、基因操作的基本技术
（二）核酸分子杂交
1、Southern吸印技术
2、Northern吸印技术
（三）细菌转化
三、基因工程的成就与展望
（一）寄主控制的限制与修饰现象和内切酶的发现
第二章 基因操作的工具酶
一、限制性核酸内切酶与DNA分子的切割
（二）限制性核酸内切酶的分类和命名
1、分类
2、命名法
（三）I型核酸内切限制酶的基本特征
1、粘性末端与平末端
2、识别序列在DNA分子上出现的频率
（四）内切酶限制消化反应条件
1、限制消化的操作过程
2、影响核酸内切限制酶活性的因素
（一）DNA连接酶
1、连接酶的作用机理
二、连接酶和DNA分子的连接
（二）DNA片段的连接
1、粘性末端DNA片段的连接
2、DNA连接酶的反应条件
2、平末端DNA片段的连接
3、同聚物谱尾连接平末端DNA片段
4、用衔接物连接平末端DNA分子
三、DNA聚合酶
（一）大肠杆菌DNA聚合酶I
（二）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记
（三）T4DNA聚合酶
（四）逆转录酶
（一）核酸酶SI
四、DNA和RNA的修饰酶
（二）末端脱氧核苷酰转移酶
（三）外核酸酶III
（四）外核酸酶Ba131
（五）T4多核苷酸激酶
（六）碱性磷酸化酶
（一）质粒的一般生物学特性
1、质粒DNA
第三章 基因克隆载体
一、质粒载体
2、质粒的类型
3、质粒的复制类型
4、质粒的不亲和性
（二）质粒载体的选择
1、理想质粒载体的基本条件
5、质粒的存在形式和分离
2、不同载体类型的选用
（三）大肠杆菌质粒载体
1、PSC101质粒载体
2、ColEI质粒载体
3、pBR322质粒载体
4、部分大肠杆菌质粒载体的基本性质
二、噬菌体载体
（一）噬菌体的一般生物学特性
（二）λ噬菌体载体
1、λDNA分子
2、λ噬菌体载体的构建
3、λ噬菌体载体的应用
4、常用入噬菌体载体
（三）柯斯质粒载体
1、柯斯质粒载体的组成
2、柯斯质粒载体的特点
3、柯斯质粒载体的应用
（四）单链DNA噬菌体载体
1、M13噬菌体的一般生物学特性
2、M13载体
3、M13载体的特点及应用
（一）在酵母细胞中克隆基因常用的载体
1、整合型载体
三、真核细胞的克隆载体
2、复制型载体
3、附加体型载体
（二）植物基因克隆的载体——Ti质粒
1、Ti质粒的结构和特性
2、Ti质粒的作用
（三）动物细胞基因克隆的载体
1、SV40病毒
2、SV40病毒载体
四、各级载体的简表
第四章 基因分离与重组及重组体向缩主细胞的导入
（一）化学合成基因
一、目的基因的获得
（二）基因文库的构建及基因分离
（三）从真核生物分离纯化目的基因的一般方法——逆转录法
1、总RNA提取
2、mRNA的分离与纯化
3、mRNA转译活性的鉴定
4、逆转录合成双链cDNA
5、cDNA基因文库的建立
（二）目的基因与载体的连接
（一）质粒DNA的分离纯化
二、重组体的构建
1、外源DNA片段定向插入载体分子
2、非互补粘性末端DNA分子的连接
3、连接反应的条件
三、重组体向宿主细胞的导入
（一）重组体DNA分子的转化或转染
（二）重组体的体外包装及λ噬菌体的转导
第五章 重组体克隆的筛选与鉴定
（一）利用载体提供的表型特征筛选重组体分子
1、抗药性标记插入失活筛选法
一、利用表型特征筛选
2、β-半乳糖苷酶显色反应选择法
（二）利用插入序列提供的表型特征筛选
（三）利用噬菌斑形成筛选
二、利用核酸杂交筛选
（一）原位杂交筛选过程
（二）核酸杂交检测的探针
三、利用免疫学方法筛选
（一）放射性抗体检测法
（二）免疫沉淀检测法
四、转译筛选法
（一）阻断转译杂交法
（二）杂交释放转译法
（一）电泳法筛选
五、物理筛选法
（二）R一环检测法
第六章 克隆基因的表达
（一）有效转录
一、基因表达的基本条件
1、启动子
2、终止子
3、RNA合成的不同阶段
4、真核生物与原核生物转录的区别
（二）正确转译
1、起始密码子
2、核糖体结合位点
3、转译的三个步骤
（一）启动子的性质
4、转译后的修饰与加工
二、启动子的性质及克隆基因的高效表达
（二）常用于表达载体的启动子
1、Lac启动子
2、trp启动子
3、tac启动子
4、λPL启动子
（三）提高克隆基因表达效率的途径
1、启动子结构对表达效率的影响
2、转译起始序列对表达效率的影响
3、启动子同克隆基因间隔距离对表达效率的影响
4、转录终止区对克隆基因表达效率的影响
5、质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响
三、原核有效表达载体的构建
（二）启动子的选择
（一）只带E.coli启动子的最简单表达载体
（三）转录表达载体的应用
1、可提供全部表达信号的盒式载体
2、合成融合蛋白的盒式载体
3、几种常用的表达载体
（四）大肠杆菌生产重组蛋白的共同问题
1、转录水平
2、转录和转译之间的情况
3、转译水平
4、转译之后
（一）胰岛素基因在大肠杆菌细胞中的表达
5、细胞水平
四、真核基因在原核生物中表达的实现
（二）生长激素释放抑制因子基因在大肠杆菌中的表达
（一）基因定位
第七章 基因工程在生物学研究中的应用
一、怎样研究克隆的基因
1、遗传重组值定位
2、家系分析定位
3、非整倍体定位
4、细胞学定位
5、体细胞杂种定位
6、基因转移定位
7、物理学定位
（二）基因序列分析
1、Sanger-coulson方法——M13单链终止法
2、Maxam-Gilbert化学降解法
3、DNA序列连续测定法
4、DNA长序列的拼接
5、DNA测序的能力及新方法
（三）基因表达的调控
1、转译水平的调控
2、转录水平的调控
（一）线粒体基因研究
二、基因工程在生物学研究中的应用
1、用标准技术定位线粒体基因
2、线粒体基因组DNA测序
3、线粒体DNA测序的几个惊人发现
（二）叶绿体基因工程研究
1、光合作用基因工程的主要目标
2、叶绿体基因工程的研究进展
（三）种子储藏物质的生物合成
1、种子具重要的营养价值
2、氨基酸缺乏问题
（四）基因克隆的未来展望
1、重组方法生产非蛋白产物
2、转基因动、植物
3、植物和动物细胞培养
主要参考书目
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