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简介
本书按照基因工程的技术路线对基因工程的技术基础、基因克隆载体、目的基因的克隆、重组DNA导人受体细胞、克隆子的筛选与表达产物的检测及基因工程的应用与安全性问题等内容作了简要系统的介绍。全书共分九章，第一章介绍了基因工程含义、主要操作内容、技术路线、发展历程及其意义。第二章介绍了基因工程的技术基础。第三章介绍了基因的克隆和分离理论，包括基因分离克隆的基本步骤、cDNA文库的构建与目的cDNA 克隆的筛选、基因组DNA克隆技术等。第四章介绍了基因克隆的载体，主要包括质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、M13载体和表达型载体等。第五章介绍了目的基因导入受体细胞，包括受体细胞的概念及其选择的原则，重组DNA转化技术和重组子的筛选技术。第六章介绍了外源基因的表达，包括外源基因的表达和调控机制、几类外源基因表达系统及表达产物的检测与分离纯化等。第七章、第八章介绍了基因工程的应用和基因工程的争论与安全措施。第九章是基因工程基本实验实训，包括DNA和RNA的提取、分离和定量分析，目的基因的PCR扩增，目的基因与载体连接与检测，感受态细菌的制备，重组DNA的转化及核酸探针制备与Southern印迹杂交。通过这些实验实训，可以使学生掌握基因工程基本实验技能，加深对基本理论和基本知识的理解。
本书的理论知识部分，概念表述准确、内容简明扼要、结构紧凑有序，脉络清晰；实验部分，应用性、实用性和操作性强，内容由简到繁、循序渐进，注重学生动手能力和思维能力培养，为学生毕业后进人生物技术高新科技产业奠定基础。
本书适用于全国高职高专院校、成教学院的生物技术、生物制药、医学、食品加工、畜牧兽医、农艺、园林园艺等专业的教学和培训，也可作为农、林、师范院校生物类本科专业教学、科研的参考用书。
目录
目 录
1基因工程概述
1.1基因工程概貌
1.1.1基因工程的诞生和兴起
1.1.2基因工程的特点与基本步骤
1.1.3基因工程早期的开创性研究成就
1.2基因工程技术的应用与发展趋势
1.2.1全球性的基因工程争夺战
1.2.2蛋白质工程的研究开发飞速发展
1.2.3转基因动植物生产药物的研究迅速崛起
1.2.4 医学科学研究取得巨大成就
1.2.5基因治疗技术取得重大进展
1.2.6规模空前的国际《人类基因组计划》提前完成
1.3基因工程与生物制药
1.3.1 基因工程制药发展态势
1.3.2主要基因工程药物简介
2基因工程常用的工具酶
2.1限制性核酸内切酶
2.1.1限制酶的发现
2.1.2限制酶的种类
2.1.3限制酶的命名
2.1.4 Ⅱ型限制酶的特性
2.1.5限制片段末端连接
2.2 DNA连接酶
2.2.1 DNA连接酶连接作用的特点
2.2.2基因工程中常用的连接酶
2.2.3 DNA连接酶连接作用的分子机理
2.3 DNA聚合酶
2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
2.3.2 Klenow大片段酶
2.3.3 T4噬菌体DNAR聚合酶
2.3.4经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶
2.3.5 TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶
2.3.6反转录酶
2.4 DNA修饰酶
2.4.1末端脱氧核苷酸转移酶
2.4.2碱性磷酸酶
2.4.3 T4噬菌体多核苷酸激酶
2.5单链核酸内切酶
2.5.1 S1核酸酶
2.5.2 Ba131核酸酶
2.6核酸外切酶
2.6.1核酸外切酶Ⅶ
2.6.2核酸外切酶Ⅲ
2.6.3λ核酸外切酶
3基因工程常用的克隆载体
3.1质粒载体
3.1.1质粒概述
3.1.2质粒DNA分子的特性
3.1.3质粒载体的改造和构建
3.1.4 pBR322质粒载体
3.1.5 pUC质粒载体
3.1.6其他重要的质粒载体
3.2λ噬菌体载体
3.2.1λ噬菌体的基本特性
3.2.2λ噬菌体基因组的结构与功能
3.2.3λ噬菌体载体的构建
3.2.4常用的λ噬菌体载体
3.2.5改良型λ噬菌体载体
3.3粘粒载体
3.3.1粘粒载体的构建
3.3.2粘粒载体的特点
3.3.3常用的粘粒载体
3.4 M13噬菌体载体
3.4.1 M13噬菌体的基本特性
3.4.2 M13噬菌体载体的构建
3.4.3 M13噬菌体载体系列的优点
3.5噬菌粒载体
3.5.1 pUC118和pUC119噬菌粒载体
3.5.2 pBluescript噬菌粒载体
3.6哺乳动物细胞载体系统
3.6.1 SV40载体
3.6.2牛乳头瘤病毒（BPV）载体
3.6.3 EBV病毒载体
4目的基因的制取
4.1 目的基因的化学合成
4.1.1 目的基因的设计
4.1.2寡聚核苷酸片段的合成
4.1.3寡核苷酸片段的分离和纯化
4.1.4用寡核苷酸片段组装目的基因
4.1.5化学合成寡核苷酸的其他用途
4.2构建基因文库法分离目的基因
4.2.1构建基因文库法分离目的基因的基本步骤
4.2.2真核基因组DNA文库的构建过程
4.3酶促合成法制取目的基因
4.3.1 真核生物细胞中的mRNA
4.3.2 从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA
4.3.3 RT-PCR法合成目的cDNA
5目的基因与克隆载体的体外重组
5.1 目的基因与质粒载体的连接
5.1.1粘性末端连接法
5.1.2定向克隆法
5.1.3平末端连接法
5.1.4同聚物加尾法
5.1.5加人工接头连接法
5.1.6加DNA衔接物连接法
5.1.7其他转换末端形式连接法
5.2目的基因与λ噬菌体载体的连接
5.2.1 λ噬菌体载体臂DNA的制备
5.2.2λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接
6重组克隆载体引入受体细胞
6.1基因工程受体细胞
6.1.1 受体细胞的特性
6.1.2重组体分子导入受体细胞的途径
6.2重组体DNA分子的转化或转染
6.2.1 用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法
6.2.2用复合剂制备感受态细胞转化法
6.2.3 高压电穿孔转化法（电转化法）
6.3重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导
6.3.1λ噬菌体体外包装的基本原理
6.3.2λ噬菌体DNA的体外包装
6.3.3 包装提取物的制备
6.3.4 重组λDNA的体外包装与感染方法
6.4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
6.4.1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法
6.4.2 DEAE－葡聚糖介导转染法
6.4.3 利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法
6.4.4利用原生质体融合的DNA转染法
6.4.5 电穿孔法DNA转染
7含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析
7.1重组体（菌）的筛选
7.1.1 抗生素抗性基因插入失活法
7.1.2 β－半乳糖苷酶基因插入失活法
7.1.3快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法
7.1.4放射性标记核酸探针杂交筛选法
7.1.5免疫化学筛选法
7.2重组体的鉴定
7.2.1酶切及凝胶电泳鉴定法
7.2.2 Southern印迹杂交法
7.2.3电镜R－环检测法
7.2.4基因产物鉴定法
7.3重组DNA的序列分析
7.3.1 Sanger双脱氧链终止法DNA测序
7.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序
7.3.3快速自动化DNA测序
8目的基因在宿主细胞中的表达
8.1外源目的基因在原核细胞中的表达
8.1.1原核基因表达载体的构成
8.1.2常见的原核细胞表达载体系统
8.1.3 外源目的基因在原核细胞的表达形式
8.1.4在原核细胞中高效表达目的基因
8.1.5基因定点诱变技术
8.2外源目的基因在真核细胞中的表达
8.2.1真核细胞表达载体的功能元件
8.2.2酵母菌表达系统
8.2.3哺乳动物细胞表达系统
9基因工程药物无性繁殖系的组建
9.1人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建
9.1.1 重组表达质粒pJG202的构建与鉴定
9.1.2重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达
9.1.3融合蛋白后处理成为人胰岛素原
9.2人α2b型干扰素工程菌的组建
9.2.1 hIFN-α2b基因的获得
9.2.2重组表达质粒pMZI2B的构建
9.2.3人α2b型干扰素工程菌的形成与基因的表达
9.3集落刺激因子工程菌的组建
9.3.1 细胞总RNA的提取
9.3.2 PCR引物的设计与合成
9.3.3 RT-PCR法制备GM-CSF cDNA
9.3.4 GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建
9.4白细胞介素融合蛋白工程菌的组建
9.4.1质粒与PCR引物
9.4.2人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造
9.4.3 IL2-PE-pLY5重组质粒的构建
9.5乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建
9.5.1 BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建
9.5.2重组表达质粒的转化及HBsAg的表达
9.5.3重组表达质粒在酵母细胞中的稳定性
9.6人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建
9.6.1真核表达质粒pLFrGGI的构建
9.6.2 高效表达FrGGI（tPA突变体）的CHO细胞株的获得
9.6.3去除dhfr基因转录增强子的作用
9.7红细胞生成素CHO细胞株的组建
9.7.1质粒与细胞株
9.7.2 EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建
9.7.3重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达
9.7.4重组表达质粒转染CHO-dhfr－细胞及EPO表达
9.8人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建
9.8.1 含hTNF-α基因的重组质粒的构建
9.8.2共转染与重组病毒的获得
9.8.3重组病毒感染Sf21细胞及hTNF-α的表达
10基因工程药物的生产
10.1基因工程菌（细胞）的培养与发酵
10.1.1 工程细菌的培养与发酵
10.1.2工程酵母的培养与发酵
10.1.3工程细胞的培养与发酵
10.2基因工程药物的分离纯化
10.2.1 影响分离纯化工艺设计的主要因素
10.2.2各种产物表达形式采用的分离纯化方法
10.3基因工程药物的分离纯化实例
10.3.1 以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化
10.3.2以分泌型表达的人α1－干扰素的分离纯化
10.3.3以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化
10.3.4在酵母中表达的HBsAg的分离纯化
11基因工程药物的检验
11.1基因工程药物的质量控制
11.1.1 主要的基因工程药物
11.1.2基因工程药物的特点
11.1.3基因工程药物的质量要求
11.1.4基因工程药物的质控要点
11.1.5基因工程药物的制造及检定规程
11.2基因工程药物常用的检验方法
11.2.1化学检定法
11.2.2肽图分析法
11.2.3 外源性DNA残留量的测定
11.2.4宿主细胞蛋白杂质的检测
11.2.5无菌试验
11.2.6内毒素试验
11.2.7异常毒性试验
11.2.8热原质试验
11.2.9生物学活性（效价）检定
11.3主要基因工程药物的检验
11.3.1重组人胰岛素的检验
11.3.2重组人生长激素的检验
11.3.3重组人干扰素的检验
11.3.4重组人白细胞介素的检验
11.3.5重组人红细胞生成素的检验
11.3.6重组人集落刺激因子的检验
11.3.7重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验
11.3.8重组人肿瘤坏死因子的检验
11.3.9重组乙型肝炎疫苗的检验
附录
参考文献
目 录
1基因工程概述
1.1基因工程概貌
1.1.1基因工程的诞生和兴起
1.1.2基因工程的特点与基本步骤
1.1.3基因工程早期的开创性研究成就
1.2基因工程技术的应用与发展趋势
1.2.1全球性的基因工程争夺战
1.2.2蛋白质工程的研究开发飞速发展
1.2.3转基因动植物生产药物的研究迅速崛起
1.2.4 医学科学研究取得巨大成就
1.2.5基因治疗技术取得重大进展
1.2.6规模空前的国际《人类基因组计划》提前完成
1.3基因工程与生物制药
1.3.1 基因工程制药发展态势
1.3.2主要基因工程药物简介
2基因工程常用的工具酶
2.1限制性核酸内切酶
2.1.1限制酶的发现
2.1.2限制酶的种类
2.1.3限制酶的命名
2.1.4 Ⅱ型限制酶的特性
2.1.5限制片段末端连接
2.2 DNA连接酶
2.2.1 DNA连接酶连接作用的特点
2.2.2基因工程中常用的连接酶
2.2.3 DNA连接酶连接作用的分子机理
2.3 DNA聚合酶
2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
2.3.2 Klenow大片段酶
2.3.3 T4噬菌体DNAR聚合酶
2.3.4经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶
2.3.5 TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶
2.3.6反转录酶
2.4 DNA修饰酶
2.4.1末端脱氧核苷酸转移酶
2.4.2碱性磷酸酶
2.4.3 T4噬菌体多核苷酸激酶
2.5单链核酸内切酶
2.5.1 S1核酸酶
2.5.2 Ba131核酸酶
2.6核酸外切酶
2.6.1核酸外切酶Ⅶ
2.6.2核酸外切酶Ⅲ
2.6.3λ核酸外切酶
3基因工程常用的克隆载体
3.1质粒载体
3.1.1质粒概述
3.1.2质粒DNA分子的特性
3.1.3质粒载体的改造和构建
3.1.4 pBR322质粒载体
3.1.5 pUC质粒载体
3.1.6其他重要的质粒载体
3.2λ噬菌体载体
3.2.1λ噬菌体的基本特性
3.2.2λ噬菌体基因组的结构与功能
3.2.3λ噬菌体载体的构建
3.2.4常用的λ噬菌体载体
3.2.5改良型λ噬菌体载体
3.3粘粒载体
3.3.1粘粒载体的构建
3.3.2粘粒载体的特点
3.3.3常用的粘粒载体
3.4 M13噬菌体载体
3.4.1 M13噬菌体的基本特性
3.4.2 M13噬菌体载体的构建
3.4.3 M13噬菌体载体系列的优点
3.5噬菌粒载体
3.5.1 pUC118和pUC119噬菌粒载体
3.5.2 pBluescript噬菌粒载体
3.6哺乳动物细胞载体系统
3.6.1 SV40载体
3.6.2牛乳头瘤病毒（BPV）载体
3.6.3 EBV病毒载体
4目的基因的制取
4.1 目的基因的化学合成
4.1.1 目的基因的设计
4.1.2寡聚核苷酸片段的合成
4.1.3寡核苷酸片段的分离和纯化
4.1.4用寡核苷酸片段组装目的基因
4.1.5化学合成寡核苷酸的其他用途
4.2构建基因文库法分离目的基因
4.2.1构建基因文库法分离目的基因的基本步骤
4.2.2真核基因组DNA文库的构建过程
4.3酶促合成法制取目的基因
4.3.1 真核生物细胞中的mRNA
4.3.2 从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA
4.3.3 RT-PCR法合成目的cDNA
5目的基因与克隆载体的体外重组
5.1 目的基因与质粒载体的连接
5.1.1粘性末端连接法
5.1.2定向克隆法
5.1.3平末端连接法
5.1.4同聚物加尾法
5.1.5加人工接头连接法
5.1.6加DNA衔接物连接法
5.1.7其他转换末端形式连接法
5.2目的基因与λ噬菌体载体的连接
5.2.1 λ噬菌体载体臂DNA的制备
5.2.2λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接
6重组克隆载体引入受体细胞
6.1基因工程受体细胞
6.1.1 受体细胞的特性
6.1.2重组体分子导入受体细胞的途径
6.2重组体DNA分子的转化或转染
6.2.1 用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法
6.2.2用复合剂制备感受态细胞转化法
6.2.3 高压电穿孔转化法（电转化法）
6.3重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导
6.3.1λ噬菌体体外包装的基本原理
6.3.2λ噬菌体DNA的体外包装
6.3.3 包装提取物的制备
6.3.4 重组λDNA的体外包装与感染方法
6.4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
6.4.1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法
6.4.2 DEAE－葡聚糖介导转染法
6.4.3 利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法
6.4.4利用原生质体融合的DNA转染法
6.4.5 电穿孔法DNA转染
7含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析
7.1重组体（菌）的筛选
7.1.1 抗生素抗性基因插入失活法
7.1.2 β－半乳糖苷酶基因插入失活法
7.1.3快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法
7.1.4放射性标记核酸探针杂交筛选法
7.1.5免疫化学筛选法
7.2重组体的鉴定
7.2.1酶切及凝胶电泳鉴定法
7.2.2 Southern印迹杂交法
7.2.3电镜R－环检测法
7.2.4基因产物鉴定法
7.3重组DNA的序列分析
7.3.1 Sanger双脱氧链终止法DNA测序
7.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序
7.3.3快速自动化DNA测序
8目的基因在宿主细胞中的表达
8.1外源目的基因在原核细胞中的表达
8.1.1原核基因表达载体的构成
8.1.2常见的原核细胞表达载体系统
8.1.3 外源目的基因在原核细胞的表达形式
8.1.4在原核细胞中高效表达目的基因
8.1.5基因定点诱变技术
8.2外源目的基因在真核细胞中的表达
8.2.1真核细胞表达载体的功能元件
8.2.2酵母菌表达系统
8.2.3哺乳动物细胞表达系统
9基因工程药物无性繁殖系的组建
9.1人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建
9.1.1 重组表达质粒pJG202的构建与鉴定
9.1.2重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达
9.1.3融合蛋白后处理成为人胰岛素原
9.2人α2b型干扰素工程菌的组建
9.2.1 hIFN-α2b基因的获得
9.2.2重组表达质粒pMZI2B的构建
9.2.3人α2b型干扰素工程菌的形成与基因的表达
9.3集落刺激因子工程菌的组建
9.3.1 细胞总RNA的提取
9.3.2 PCR引物的设计与合成
9.3.3 RT-PCR法制备GM-CSF cDNA
9.3.4 GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建
9.4白细胞介素融合蛋白工程菌的组建
9.4.1质粒与PCR引物
9.4.2人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造
9.4.3 IL2-PE-pLY5重组质粒的构建
9.5乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建
9.5.1 BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建
9.5.2重组表达质粒的转化及HBsAg的表达
9.5.3重组表达质粒在酵母细胞中的稳定性
9.6人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建
9.6.1真核表达质粒pLFrGGI的构建
9.6.2 高效表达FrGGI（tPA突变体）的CHO细胞株的获得
9.6.3去除dhfr基因转录增强子的作用
9.7红细胞生成素CHO细胞株的组建
9.7.1质粒与细胞株
9.7.2 EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建
9.7.3重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达
9.7.4重组表达质粒转染CHO-dhfr－细胞及EPO表达
9.8人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建
9.8.1 含hTNF-α基因的重组质粒的构建
9.8.2共转染与重组病毒的获得
9.8.3重组病毒感染Sf21细胞及hTNF-α的表达
10基因工程药物的生产
10.1基因工程菌（细胞）的培养与发酵
10.1.1 工程细菌的培养与发酵
10.1.2工程酵母的培养与发酵
10.1.3工程细胞的培养与发酵
10.2基因工程药物的分离纯化
10.2.1 影响分离纯化工艺设计的主要因素
10.2.2各种产物表达形式采用的分离纯化方法
10.3基因工程药物的分离纯化实例
10.3.1 以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化
10.3.2以分泌型表达的人α1－干扰素的分离纯化
10.3.3以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化
10.3.4在酵母中表达的HBsAg的分离纯化
11基因工程药物的检验
11.1基因工程药物的质量控制
11.1.1 主要的基因工程药物
11.1.2基因工程药物的特点
11.1.3基因工程药物的质量要求
11.1.4基因工程药物的质控要点
11.1.5基因工程药物的制造及检定规程
11.2基因工程药物常用的检验方法
11.2.1化学检定法
11.2.2肽图分析法
11.2.3 外源性DNA残留量的测定
11.2.4宿主细胞蛋白杂质的检测
11.2.5无菌试验
11.2.6内毒素试验
11.2.7异常毒性试验
11.2.8热原质试验
11.2.9生物学活性（效价）检定
11.3主要基因工程药物的检验
11.3.1重组人胰岛素的检验
11.3.2重组人生长激素的检验
11.3.3重组人干扰素的检验
11.3.4重组人白细胞介素的检验
11.3.5重组人红细胞生成素的检验
11.3.6重组人集落刺激因子的检验
11.3.7重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验
11.3.8重组人肿瘤坏死因子的检验
11.3.9重组乙型肝炎疫苗的检验
附录
参考文献
1基因工程概述
1.1基因工程概貌
1.1.1基因工程的诞生和兴起
1.1.2基因工程的特点与基本步骤
1.1.3基因工程早期的开创性研究成就
1.2基因工程技术的应用与发展趋势
1.2.1全球性的基因工程争夺战
1.2.2蛋白质工程的研究开发飞速发展
1.2.3转基因动植物生产药物的研究迅速崛起
1.2.4 医学科学研究取得巨大成就
1.2.5基因治疗技术取得重大进展
1.2.6规模空前的国际《人类基因组计划》提前完成
1.3基因工程与生物制药
1.3.1 基因工程制药发展态势
1.3.2主要基因工程药物简介
2基因工程常用的工具酶
2.1限制性核酸内切酶
2.1.1限制酶的发现
2.1.2限制酶的种类
2.1.3限制酶的命名
2.1.4 Ⅱ型限制酶的特性
2.1.5限制片段末端连接
2.2 DNA连接酶
2.2.1 DNA连接酶连接作用的特点
2.2.2基因工程中常用的连接酶
2.2.3 DNA连接酶连接作用的分子机理
2.3 DNA聚合酶
2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
2.3.2 Klenow大片段酶
2.3.3 T4噬菌体DNAR聚合酶
2.3.4经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶
2.3.5 TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶
2.3.6反转录酶
2.4 DNA修饰酶
2.4.1末端脱氧核苷酸转移酶
2.4.2碱性磷酸酶
2.4.3 T4噬菌体多核苷酸激酶
2.5单链核酸内切酶
2.5.1 S1核酸酶
2.5.2 Ba131核酸酶
2.6核酸外切酶
2.6.1核酸外切酶Ⅶ
2.6.2核酸外切酶Ⅲ
2.6.3λ核酸外切酶
3基因工程常用的克隆载体
3.1质粒载体
3.1.1质粒概述
3.1.2质粒DNA分子的特性
3.1.3质粒载体的改造和构建
3.1.4 pBR322质粒载体
3.1.5 pUC质粒载体
3.1.6其他重要的质粒载体
3.2λ噬菌体载体
3.2.1λ噬菌体的基本特性
3.2.2λ噬菌体基因组的结构与功能
3.2.3λ噬菌体载体的构建
3.2.4常用的λ噬菌体载体
3.2.5改良型λ噬菌体载体
3.3粘粒载体
3.3.1粘粒载体的构建
3.3.2粘粒载体的特点
3.3.3常用的粘粒载体
3.4 M13噬菌体载体
3.4.1 M13噬菌体的基本特性
3.4.2 M13噬菌体载体的构建
3.4.3 M13噬菌体载体系列的优点
3.5噬菌粒载体
3.5.1 pUC118和pUC119噬菌粒载体
3.5.2 pBluescript噬菌粒载体
3.6哺乳动物细胞载体系统
3.6.1 SV40载体
3.6.2牛乳头瘤病毒（BPV）载体
3.6.3 EBV病毒载体
4目的基因的制取
4.1 目的基因的化学合成
4.1.1 目的基因的设计
4.1.2寡聚核苷酸片段的合成
4.1.3寡核苷酸片段的分离和纯化
4.1.4用寡核苷酸片段组装目的基因
4.1.5化学合成寡核苷酸的其他用途
4.2构建基因文库法分离目的基因
4.2.1构建基因文库法分离目的基因的基本步骤
4.2.2真核基因组DNA文库的构建过程
4.3酶促合成法制取目的基因
4.3.1 真核生物细胞中的mRNA
4.3.2 从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA
4.3.3 RT-PCR法合成目的cDNA
5目的基因与克隆载体的体外重组
5.1 目的基因与质粒载体的连接
5.1.1粘性末端连接法
5.1.2定向克隆法
5.1.3平末端连接法
5.1.4同聚物加尾法
5.1.5加人工接头连接法
5.1.6加DNA衔接物连接法
5.1.7其他转换末端形式连接法
5.2目的基因与λ噬菌体载体的连接
5.2.1 λ噬菌体载体臂DNA的制备
5.2.2λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接
6重组克隆载体引入受体细胞
6.1基因工程受体细胞
6.1.1 受体细胞的特性
6.1.2重组体分子导入受体细胞的途径
6.2重组体DNA分子的转化或转染
6.2.1 用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法
6.2.2用复合剂制备感受态细胞转化法
6.2.3 高压电穿孔转化法（电转化法）
6.3重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导
6.3.1λ噬菌体体外包装的基本原理
6.3.2λ噬菌体DNA的体外包装
6.3.3 包装提取物的制备
6.3.4 重组λDNA的体外包装与感染方法
6.4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
6.4.1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法
6.4.2 DEAE－葡聚糖介导转染法
6.4.3 利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法
6.4.4利用原生质体融合的DNA转染法
6.4.5 电穿孔法DNA转染
7含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析
7.1重组体（菌）的筛选
7.1.1 抗生素抗性基因插入失活法
7.1.2 β－半乳糖苷酶基因插入失活法
7.1.3快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法
7.1.4放射性标记核酸探针杂交筛选法
7.1.5免疫化学筛选法
7.2重组体的鉴定
7.2.1酶切及凝胶电泳鉴定法
7.2.2 Southern印迹杂交法
7.2.3电镜R－环检测法
7.2.4基因产物鉴定法
7.3重组DNA的序列分析
7.3.1 Sanger双脱氧链终止法DNA测序
7.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序
7.3.3快速自动化DNA测序
8目的基因在宿主细胞中的表达
8.1外源目的基因在原核细胞中的表达
8.1.1原核基因表达载体的构成
8.1.2常见的原核细胞表达载体系统
8.1.3 外源目的基因在原核细胞的表达形式
8.1.4在原核细胞中高效表达目的基因
8.1.5基因定点诱变技术
8.2外源目的基因在真核细胞中的表达
8.2.1真核细胞表达载体的功能元件
8.2.2酵母菌表达系统
8.2.3哺乳动物细胞表达系统
9基因工程药物无性繁殖系的组建
9.1人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建
9.1.1 重组表达质粒pJG202的构建与鉴定
9.1.2重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达
9.1.3融合蛋白后处理成为人胰岛素原
9.2人α2b型干扰素工程菌的组建
9.2.1 hIFN-α2b基因的获得
9.2.2重组表达质粒pMZI2B的构建
9.2.3人α2b型干扰素工程菌的形成与基因的表达
9.3集落刺激因子工程菌的组建
9.3.1 细胞总RNA的提取
9.3.2 PCR引物的设计与合成
9.3.3 RT-PCR法制备GM-CSF cDNA
9.3.4 GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建
9.4白细胞介素融合蛋白工程菌的组建
9.4.1质粒与PCR引物
9.4.2人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造
9.4.3 IL2-PE-pLY5重组质粒的构建
9.5乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建
9.5.1 BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建
9.5.2重组表达质粒的转化及HBsAg的表达
9.5.3重组表达质粒在酵母细胞中的稳定性
9.6人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建
9.6.1真核表达质粒pLFrGGI的构建
9.6.2 高效表达FrGGI（tPA突变体）的CHO细胞株的获得
9.6.3去除dhfr基因转录增强子的作用
9.7红细胞生成素CHO细胞株的组建
9.7.1质粒与细胞株
9.7.2 EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建
9.7.3重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达
9.7.4重组表达质粒转染CHO-dhfr－细胞及EPO表达
9.8人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建
9.8.1 含hTNF-α基因的重组质粒的构建
9.8.2共转染与重组病毒的获得
9.8.3重组病毒感染Sf21细胞及hTNF-α的表达
10基因工程药物的生产
10.1基因工程菌（细胞）的培养与发酵
10.1.1 工程细菌的培养与发酵
10.1.2工程酵母的培养与发酵
10.1.3工程细胞的培养与发酵
10.2基因工程药物的分离纯化
10.2.1 影响分离纯化工艺设计的主要因素
10.2.2各种产物表达形式采用的分离纯化方法
10.3基因工程药物的分离纯化实例
10.3.1 以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化
10.3.2以分泌型表达的人α1－干扰素的分离纯化
10.3.3以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化
10.3.4在酵母中表达的HBsAg的分离纯化
11基因工程药物的检验
11.1基因工程药物的质量控制
11.1.1 主要的基因工程药物
11.1.2基因工程药物的特点
11.1.3基因工程药物的质量要求
11.1.4基因工程药物的质控要点
11.1.5基因工程药物的制造及检定规程
11.2基因工程药物常用的检验方法
11.2.1化学检定法
11.2.2肽图分析法
11.2.3 外源性DNA残留量的测定
11.2.4宿主细胞蛋白杂质的检测
11.2.5无菌试验
11.2.6内毒素试验
11.2.7异常毒性试验
11.2.8热原质试验
11.2.9生物学活性（效价）检定
11.3主要基因工程药物的检验
11.3.1重组人胰岛素的检验
11.3.2重组人生长激素的检验
11.3.3重组人干扰素的检验
11.3.4重组人白细胞介素的检验
11.3.5重组人红细胞生成素的检验
11.3.6重组人集落刺激因子的检验
11.3.7重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验
11.3.8重组人肿瘤坏死因子的检验
11.3.9重组乙型肝炎疫苗的检验
附录
参考文献
目 录
1基因工程概述
1.1基因工程概貌
1.1.1基因工程的诞生和兴起
1.1.2基因工程的特点与基本步骤
1.1.3基因工程早期的开创性研究成就
1.2基因工程技术的应用与发展趋势
1.2.1全球性的基因工程争夺战
1.2.2蛋白质工程的研究开发飞速发展
1.2.3转基因动植物生产药物的研究迅速崛起
1.2.4 医学科学研究取得巨大成就
1.2.5基因治疗技术取得重大进展
1.2.6规模空前的国际《人类基因组计划》提前完成
1.3基因工程与生物制药
1.3.1 基因工程制药发展态势
1.3.2主要基因工程药物简介
2基因工程常用的工具酶
2.1限制性核酸内切酶
2.1.1限制酶的发现
2.1.2限制酶的种类
2.1.3限制酶的命名
2.1.4 Ⅱ型限制酶的特性
2.1.5限制片段末端连接
2.2 DNA连接酶
2.2.1 DNA连接酶连接作用的特点
2.2.2基因工程中常用的连接酶
2.2.3 DNA连接酶连接作用的分子机理
2.3 DNA聚合酶
2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
2.3.2 Klenow大片段酶
2.3.3 T4噬菌体DNAR聚合酶
2.3.4经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶
2.3.5 TaqDNA聚合酶及Ampli TaqTMDNA聚合酶
2.3.6反转录酶
2.4 DNA修饰酶
2.4.1末端脱氧核苷酸转移酶
2.4.2碱性磷酸酶
2.4.3 T4噬菌体多核苷酸激酶
2.5单链核酸内切酶
2.5.1 S1核酸酶
2.5.2 Ba131核酸酶
2.6核酸外切酶
2.6.1核酸外切酶Ⅶ
2.6.2核酸外切酶Ⅲ
2.6.3λ核酸外切酶
3基因工程常用的克隆载体
3.1质粒载体
3.1.1质粒概述
3.1.2质粒DNA分子的特性
3.1.3质粒载体的改造和构建
3.1.4 pBR322质粒载体
3.1.5 pUC质粒载体
3.1.6其他重要的质粒载体
3.2λ噬菌体载体
3.2.1λ噬菌体的基本特性
3.2.2λ噬菌体基因组的结构与功能
3.2.3λ噬菌体载体的构建
3.2.4常用的λ噬菌体载体
3.2.5改良型λ噬菌体载体
3.3粘粒载体
3.3.1粘粒载体的构建
3.3.2粘粒载体的特点
3.3.3常用的粘粒载体
3.4 M13噬菌体载体
3.4.1 M13噬菌体的基本特性
3.4.2 M13噬菌体载体的构建
3.4.3 M13噬菌体载体系列的优点
3.5噬菌粒载体
3.5.1 pUC118和pUC119噬菌粒载体
3.5.2 pBluescript噬菌粒载体
3.6哺乳动物细胞载体系统
3.6.1 SV40载体
3.6.2牛乳头瘤病毒（BPV）载体
3.6.3 EBV病毒载体
4目的基因的制取
4.1 目的基因的化学合成
4.1.1 目的基因的设计
4.1.2寡聚核苷酸片段的合成
4.1.3寡核苷酸片段的分离和纯化
4.1.4用寡核苷酸片段组装目的基因
4.1.5化学合成寡核苷酸的其他用途
4.2构建基因文库法分离目的基因
4.2.1构建基因文库法分离目的基因的基本步骤
4.2.2真核基因组DNA文库的构建过程
4.3酶促合成法制取目的基因
4.3.1 真核生物细胞中的mRNA
4.3.2 从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA
4.3.3 RT-PCR法合成目的cDNA
5目的基因与克隆载体的体外重组
5.1 目的基因与质粒载体的连接
5.1.1粘性末端连接法
5.1.2定向克隆法
5.1.3平末端连接法
5.1.4同聚物加尾法
5.1.5加人工接头连接法
5.1.6加DNA衔接物连接法
5.1.7其他转换末端形式连接法
5.2目的基因与λ噬菌体载体的连接
5.2.1 λ噬菌体载体臂DNA的制备
5.2.2λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接
6重组克隆载体引入受体细胞
6.1基因工程受体细胞
6.1.1 受体细胞的特性
6.1.2重组体分子导入受体细胞的途径
6.2重组体DNA分子的转化或转染
6.2.1 用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法
6.2.2用复合剂制备感受态细胞转化法
6.2.3 高压电穿孔转化法（电转化法）
6.3重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导
6.3.1λ噬菌体体外包装的基本原理
6.3.2λ噬菌体DNA的体外包装
6.3.3 包装提取物的制备
6.3.4 重组λDNA的体外包装与感染方法
6.4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
6.4.1 磷酸钙和DNA共沉淀物转染法
6.4.2 DEAE－葡聚糖介导转染法
6.4.3 利用Polybrene（聚季铵盐）的DNA转染法
6.4.4利用原生质体融合的DNA转染法
6.4.5 电穿孔法DNA转染
7含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析
7.1重组体（菌）的筛选
7.1.1 抗生素抗性基因插入失活法
7.1.2 β－半乳糖苷酶基因插入失活法
7.1.3快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法
7.1.4放射性标记核酸探针杂交筛选法
7.1.5免疫化学筛选法
7.2重组体的鉴定
7.2.1酶切及凝胶电泳鉴定法
7.2.2 Southern印迹杂交法
7.2.3电镜R－环检测法
7.2.4基因产物鉴定法
7.3重组DNA的序列分析
7.3.1 Sanger双脱氧链终止法DNA测序
7.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序
7.3.3快速自动化DNA测序
8目的基因在宿主细胞中的表达
8.1外源目的基因在原核细胞中的表达
8.1.1原核基因表达载体的构成
8.1.2常见的原核细胞表达载体系统
8.1.3 外源目的基因在原核细胞的表达形式
8.1.4在原核细胞中高效表达目的基因
8.1.5基因定点诱变技术
8.2外源目的基因在真核细胞中的表达
8.2.1真核细胞表达载体的功能元件
8.2.2酵母菌表达系统
8.2.3哺乳动物细胞表达系统
9基因工程药物无性繁殖系的组建
9.1人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建
9.1.1 重组表达质粒pJG202的构建与鉴定
9.1.2重组质粒pJG202在大肠杆菌中的表达
9.1.3融合蛋白后处理成为人胰岛素原
9.2人α2b型干扰素工程菌的组建
9.2.1 hIFN-α2b基因的获得
9.2.2重组表达质粒pMZI2B的构建
9.2.3人α2b型干扰素工程菌的形成与基因的表达
9.3集落刺激因子工程菌的组建
9.3.1 细胞总RNA的提取
9.3.2 PCR引物的设计与合成
9.3.3 RT-PCR法制备GM-CSF cDNA
9.3.4 GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建
9.4白细胞介素融合蛋白工程菌的组建
9.4.1质粒与PCR引物
9.4.2人IL-2 cDNA和PE基因的末端改造
9.4.3 IL2-PE-pLY5重组质粒的构建
9.5乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建
9.5.1 BsAg基因重组表达质粒pLS1和pLS2的构建
9.5.2重组表达质粒的转化及HBsAg的表达
9.5.3重组表达质粒在酵母细胞中的稳定性
9.6人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建
9.6.1真核表达质粒pLFrGGI的构建
9.6.2 高效表达FrGGI（tPA突变体）的CHO细胞株的获得
9.6.3去除dhfr基因转录增强子的作用
9.7红细胞生成素CHO细胞株的组建
9.7.1质粒与细胞株
9.7.2 EPO真核重组表达质粒pMGL4的构建
9.7.3重组表达质粒转染COS-7细胞及产物表达
9.7.4重组表达质粒转染CHO-dhfr－细胞及EPO表达
9.8人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建
9.8.1 含hTNF-α基因的重组质粒的构建
9.8.2共转染与重组病毒的获得
9.8.3重组病毒感染Sf21细胞及hTNF-α的表达
10基因工程药物的生产
10.1基因工程菌（细胞）的培养与发酵
10.1.1 工程细菌的培养与发酵
10.1.2工程酵母的培养与发酵
10.1.3工程细胞的培养与发酵
10.2基因工程药物的分离纯化
10.2.1 影响分离纯化工艺设计的主要因素
10.2.2各种产物表达形式采用的分离纯化方法
10.3基因工程药物的分离纯化实例
10.3.1 以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化
10.3.2以分泌型表达的人α1－干扰素的分离纯化
10.3.3以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化
10.3.4在酵母中表达的HBsAg的分离纯化
11基因工程药物的检验
11.1基因工程药物的质量控制
11.1.1 主要的基因工程药物
11.1.2基因工程药物的特点
11.1.3基因工程药物的质量要求
11.1.4基因工程药物的质控要点
11.1.5基因工程药物的制造及检定规程
11.2基因工程药物常用的检验方法
11.2.1化学检定法
11.2.2肽图分析法
11.2.3 外源性DNA残留量的测定
11.2.4宿主细胞蛋白杂质的检测
11.2.5无菌试验
11.2.6内毒素试验
11.2.7异常毒性试验
11.2.8热原质试验
11.2.9生物学活性（效价）检定
11.3主要基因工程药物的检验
11.3.1重组人胰岛素的检验
11.3.2重组人生长激素的检验
11.3.3重组人干扰素的检验
11.3.4重组人白细胞介素的检验
11.3.5重组人红细胞生成素的检验
11.3.6重组人集落刺激因子的检验
11.3.7重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验
11.3.8重组人肿瘤坏死因子的检验
11.3.9重组乙型肝炎疫苗的检验
附录
参考文献
Genetic Engineering
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