分子微生物学实验指导
作者： 柳志强
出版社：中国轻工业出版社 2017年07月
简介：
本书共包括十四章，包括微生物核酸提取，聚合酶链反应，载体连接转化，大肠杆菌表达，分子杂交，DNA和蛋白质相互作用等目前分子微生物学领域常用的实验技术，章节顺序安排基本参照常规实验的流程。每个章节在概述部分对实验原理进行了详细阐述，便于读者对实验步骤的理解；在实验步骤中，结合前人经验总结了部分注意事项，可供广大读者进行参考；每章结尾均有思考题，可用于实验的复习和加深理解；书末还附录有本书所涉及的质粒图谱及微生物常用培养基配方，可供读者参考。
【目录】
*章 琼脂糖凝胶电泳
一、实验材料
二、实验仪器
三、操作步骤
四、技术要点
第二章 基因组DNA的提取
一、从植物组织提取基因组DNA
二、从动物组织提取基因组DNA
三、细菌基因组DNA的制备
四、丝状真菌基因组DNA的制备
五、酵母基因组DNA的制备
六、基因组DNA的检测
第三章 RNA的提取和cDNA合成
一、动植物组织mRNA提取
二、植物病毒RNA提取
三、丝状真菌RNA提取
四、细菌RNA提取
五、酵母RNA提取
六、cDNA的合成
第四章 聚合酶链反应（PCR）
一、常规PCR技术
二、降落PCR
三、RACE技术
四、实时荧光定量PCR
第五章 DNA酶切
一、实验材料
二、实验仪器
三、操作步骤
四、技术要点
第六章 重组质粒的连接
一、实验材料
二、实验仪器
三、操作步骤
四、技术要点
第七章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
一、CaCl2法制备感受态细胞及转化
二、大肠杆菌超级感受态细胞的制备
三、电转化感受态细胞的制备及转化
第八章 质粒DNA的提取
一、实验材料
二、操作步骤
三、技术要点
第九章 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、实验材料
二、实验仪器
三、操作步骤
四、技术要点
第十章 融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
一、实验材料
二、实验仪器
三、操作步骤
四、技术要点
第十一章 分子杂交技术
一、核酸探针标记的方法
二、Southern 杂交
三、Northern 杂交
四、Western 杂交
五、菌落原位杂交
六、斑点杂交
七、杂交反应的条件及参数的优化
第十二章 RFLP和RAPD技术
一、RFLP技术
二、RAPD技术
第十三章 EMSA实验方案
一、实验试剂
二、操作步骤
第十四章 酵母双杂合系统筛选相互作用的蛋白
一、实验材料与方法
二、阳性克隆的进一步证实
三、注意事项
附录一 质粒图谱
附录二 常用微生物培养基配方
参考文献
【免费在线读】
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其他方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（Ethidiumbromide, EB染色），在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA片度的范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：
1. DNA的分子大小
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子质量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移的越慢。
2. 琼脂糖浓度
一个特定的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小，分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%，DNA片段介于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
3. DNA分子的构象
DNA分子在电场中移动速度不仅和分子质量有关，还和它本身构象有关。相同分子质量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动*快，而开环DNA移动*慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
4. 电源电压
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子质量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到*，所加电压不得超过5V/cm。
5. 嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。
6. 离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率*小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE [含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸] ，TBE（Tris-硼酸和EDTA），TPE（Tris-磷酸和EDTA），一般配制成浓缩母液，储于室温。
